Sin embargo, la política religiosa de James se volvió más restrictiva con el tiempo. Era cada vez más intolerante con el catolicismo y el puritanismo, y lanzó una serie de persecuciones contra estos grupos. En 1605, ordenó la ejecución de Guy Fawkes y otros conspiradores en la Conspiración de la Pólvora, un intento católico de volar las Casas del Parlamento. También aprobó una serie de leyes que restringían los derechos de los católicos, incluidas las Leyes de Recusación, que imponían fuertes multas a los católicos que se negaban a asistir a los servicios de la Iglesia de Inglaterra.
En 1610, James convocó la Conferencia de Hampton Court, que reunió a representantes de la Iglesia de Inglaterra y los puritanos. La conferencia no logró llegar a un acuerdo y los puritanos se alejaron aún más de la Iglesia de Inglaterra.
La política religiosa de James finalmente no logró sus objetivos. No pudo establecer una política moderada de tolerancia religiosa y sus persecuciones de católicos y puritanos sólo sirvieron para profundizar las divisiones religiosas en Inglaterra.
