Karloff nació en Camberwell, Londres, de un padre que era un diplomático angloindio y una madre de ascendencia mixta francesa y alemana. Comenzó su carrera como actor en el Reino Unido a principios de la década de 1910, apareciendo en producciones teatrales y películas mudas. En 1919, se mudó a Hollywood, donde inicialmente luchó por encontrar el éxito.
Protagonizó muchas de las películas de terror de Universal Studios de la década de 1930, incluidas The Old Dark House (1932), The Mask of Fu Manchu (1932), The Black Room (1935) y The Bride of Frankenstein (1935). En 1939, interpretó el papel del Dr. Frankenstein en Son of Frankenstein, la tercera película de la serie Frankenstein.
En la década de 1940, Karloff continuó apareciendo en películas de terror, pero también comenzó a expandirse hacia otros géneros, como comedia, westerns y drama. Protagonizó películas como La casa de Frankenstein (1944), Abbot y Costello conocen a Frankenstein (1948) y The Snake Pit (1948).
En la década de 1950, la carrera de Karloff comenzó a decaer, pero continuó apareciendo en películas y programas de televisión hasta su muerte en 1969.
Karloff estuvo casado dos veces, primero con Grace Radcliffe de 1915 a 1920, y luego con Dorothy Stine desde 1924 hasta su muerte. Tuvo una hija, Sara, con Radcliffe.
Karloff era un hombre alto, medía 1,93 m (6 pies y 4 pulgadas). Tenía una voz profunda y resonante que contribuyó a su éxito como actor de terror.
Era un actor respetado que era admirado tanto por sus colegas como por sus fanáticos. Es considerado uno de los mejores actores del cine de terror de todos los tiempos.
En 1999, Karloff ocupó el puesto 20 en la lista del American Film Institute de las 50 mayores leyendas de la pantalla estadounidense.
