Regresó en 1535 con tres barcos y pasó el invierno de 1535-1536 en Stadacona (cerca de la actual ciudad de Quebec), donde conoció a los iroqueses de San Lorenzo, bajo el mando del jefe Donnacona. Cartier secuestró a Donnacona y a once miembros de su tribu y los llevó a Francia, donde varios murieron a causa de enfermedades. Los demás regresaron en 1536, pero murieron poco después.
En Hochelaga (actual Montreal), Cartier conoció a otra tribu iroquesa y vio los rápidos de Lachine. Estas tribus introdujeron a Cartier en el uso de canoas, lo que hizo posible una mayor penetración tierra adentro por parte de exploradores y comerciantes de pieles.
