La Iglesia funcionaba en América, al igual que en España, con una jerarquía que atendía tanto a su componente episcopal como a la actividad religiosa.
Expansión del clero en América
Los primeros obispados se establecieron a partir de 1508, cuando se crearon las diócesis de Santo Domingo y Concepción, en La Española, y San Juan de Puerto Rico. En total, durante la época colonial se fundaron 42 obispados, la mayoría (22, 52 %) en la primera mitad del siglo XVI; la expansión se ralentizó notablemente en los siglos posteriores, con sólo 5 nuevos obispados en el siglo XVII y 6 en el XVIII. Inicialmente todas las diócesis dependían de la provincia metropolitana de Sevilla, pero pronto se decidió crear una Iglesia americana independiente para evitar el control directo de Roma.
En 1504 se creó la arquidiócesis de Yaguata, seguida de la de Santo Domingo, que abarcaba el Caribe y la costa de Tierra Firme, con las diócesis sufragáneas de Magua y Baynúa. Posteriormente se fundaron sedes arquiviscales y episcopales en centros de gran importancia política, como México (jurisdicción de Guatemala a California) y Lima (de Nicaragua a Cuzco). Con el avance de la conquista, los límites se modificaron: el territorio de la arquidiócesis de Lima se amplió para incluir Chile y el Alto Perú, y se creó la arquidiócesis de Santa Fe de Bogotá, que cubría desde Nicaragua hasta Quito.
A finales del siglo XVI existían cuatro arquidiócesis (Santo Domingo, México, Santa Fe de Bogotá y Lima) y 26 obispados. Los obispados dependían de las arquidiócesis de la siguiente forma: Santo Domingo tenía a Santiago de Cuba, San Juan de Puerto Rico y Coro; México supervisaba a Guadalajara, Valladolid, Puebla, Antioquía, Chiapas, Mérida, Verapaz, Comayagua, Guatemala y León; Santa Fe de Bogotá a Cartagena y Popayán; y Lima a Panamá, Quito, Trujillo, Cuzco, Arequipa, La Plata, Asunción, Santiago del Estero, Santiago de Chile y La Imperial. En el siglo XVII se produjeron algunos cambios: La Plata se convirtió en arquidiócesis y pasó a depender de La Paz, Mizque, Córdoba y Buenos Aires; se crearon los obispados de Durango (sometido a México), de Caracas (sustituyendo a Coro y dependiente de Santo Domingo), de Santa Marta (de Santa Fe de Bogotá) y de Huamanga (de Lima).
Organización del clero en América
En las primeras décadas del siglo XVI la escasez de clérigos seculares para dirigir parroquias y doctrinas obligó a recurrir con frecuencia a religiosos de órdenes. Esto generó conflictos de obediencia: ¿debían los religiosos que ejercían como párrocos responder a los obispos o a sus superiores provinciales? En la práctica, el clero secular respondía directamente al rey, quien los nombraba, mientras que los religiosos estaban sujetos a los superiores de sus órdenes. La falta de personal también se sintió en los niveles superiores: 142 de los 214 obispos nombrados en el siglo XVI pertenecían a alguna orden.
Los conflictos jurisdiccionales entre obispos, provinciales y autoridades laicas eran habituales, pues los patrones reales, amparados en sus derechos de patronazgo, interferían en la gestión eclesiástica. Para intentar resolver estas tensiones se crearon los consejos diocesanos, órganos consultivos de los obispos cuyas composiciones reflejaban intereses contrapuestos, lo que dificultaba a menudo la toma de decisiones. A nivel provincial se celebraron concilios provinciales siguiendo las disposiciones del Concilio de Trento. Los primeros se realizaron en México y Lima, y su objetivo principal era la evangelización de los indígenas y la atención a obras locales. Aunque el concilio debía reunirse cada tres años, Felipe II solicitó al Vaticano ampliar el intervalo a cinco años, luego a siete (1584) y doce (1610) años, sin que generalmente se cumplieran los plazos.
Se distinguieron tres tipos de establecimientos eclesiásticos: parroquias, doctrinas y misiones. Las parroquias se fundaban en ciudades con población blanca significativa y estaban a cargo de un párroco, que en ausencia de clérigos seculares era reemplazado por un religioso. Las doctrinas, similares a las encomiendas, eran parroquias rurales en territorios indígenas sedentarios; su cabecera solía ubicarse en la población más importante de la zona y el sacerdote, llamado doctrinero, a menudo se vinculaba al cacique local para obtener apoyo en la construcción de la iglesia. Las misiones, por su parte, eran escasas y se establecían en regiones periféricas donde la autoridad colonial era limitada y los levantamientos indígenas amenazaban la seguridad de los misioneros.
Evangelización del clero en América
La escasez de sacerdotes llevó a promover vocaciones indígenas desde temprano, aunque con resultados limitados. Se creía que los sacerdotes indígenas, sobre todo los de origen noble, tendrían mayor influencia al hablar la lengua y comprender las costumbres de sus feligreses. El colegio de Tlatelolco, fundado cerca de la Ciudad de México, reclutó pocos hijos de caciques con vocación religiosa; además, normas como el voto de castidad resultaban extrañas a los estudiantes. Ante esta realidad, el primer concilio mexicano restringió el acceso de los indígenas a los seminarios.
En la segunda mitad del siglo XVI se prohibió nombrar sacerdotes que no dominasen la lengua del pueblo a evangelizar, llegando incluso a contemplar exámenes de idioma antes de asumir el cargo. Se impulsó la elaboración de gramáticas, catecismos y confesionales en lenguas como náhuatl, quechua, aimara, chibcha y maya, lo que favoreció el desarrollo de la imprenta en América. Sin embargo, a mediados del siglo XVII la Corona favoreció el uso del español en detrimento de las lenguas locales, abandonando la política de apoyo lingüístico.